The Oxygraph: Type I oxidatie

[No canvas support]
µl 

Biologische oxidatie van het type I

Biologische oxidaties van het type I, zijn oxidatiereacties waarbij NADH ontstaat. In dit experiment meten we het mitochondriale zuurstofverbruik uitgaande van pyruvaat in af- en aanwezigheid van verschillende hoeveelheden ADP. (Zie uw aantekeningen van het college)

Uitvoering

    • Start de simulatie door het indrukken van "Start". Op het scherm ziet u een assenstelsel waarin de zuurstofspanning als functie van de tijd wordt weergegeven. Het signaal verschijnt als een lijn evenwijdig aan de tijd-as.
    • Voeg na ongeveer 20 seconden 10 µl pyruvaat toe. Het aanvankelijk horizontaal lopende signaal verandert van helling, m.a.w. er wordt zuurstof verbruikt.
    • Voeg na ongeveer 30 seconden 5 µl ADP toe. De helling neemt sterk toe maar na enige tijd neemt de hellingshoek weer af tot deze ongeveer gelijk wordt aan de helling die met alleen pyruvaat te meten was.
    • Voeg als deze hoeveelheid ADP verbruikt is 2 µl ADP toe. Opnieuw neemt de hellingshoek eerst toe en daarna weer af.
    • Ongeveer 30 seconden nadat het signaal evenwijdig is geworden aan het signaal zoals gemeten onder b. wordt de simulatie beëindigd door op "Stop" te klikken.
    • Op het scherm kun je de totale weergave van het experiment zien. Met behulp van de cursor, kun je op elk gewenst tijdspunt zowel de tijd, als de zuurstofconcentratie en ook de snelheid van zuurstofverbruik op dat specifieke moment aflezen. Bereken nu voor elk van de stukken het bij dat stuk behorende zuurstofverbruik in nanomolen. Vul deze waarden in de tabel in de syllabus in.
    • Voor het berekenen van de P/O-ratio moet zowel het zuurstofverbruik als de hoeveelheid gevormd ATP bekend zijn. Voor de berekening van het veresterd fosfaat gaan we ervan uit dat alle toegevoegde ADP volledig in ATP wordt omgezet. Bereken nu de P/O-ratio van dit experiment voor de toegevoegde 5 µl ADP en eventueel voor 2 µl ADP. Vul deze waarden in onderstaande tabel in.

⇒ Vragen

  1. Geef de reactievergelijking voor de oxidatie van pyruvaat tot acetyl-CoA.
  2. Wat is de theoretische P/O-ratio voor een type I oxidatie?
  3. Via welk type oxidatie verloopt de oxidatie van pyruvaat op grond van het gevonden resultaat?
  4. De ademhaling wordt dus inderdaad gecontroleerd door de beschikbaarheid van ADP in theorie zal het zuurstofverbruik in de afwezigheid van ADP miniem zijn. Waarom zult u in een oxygraafregistratie toch altijd een duidelijk zuurstofverbruik in afwezigheid van ADP meten?